Mês: junho 2021

Com a ascensão meteórica do CRISPR como uma maravilha da edição de genes, é fácil esquecer suas origens humildes: ele foi descoberto pela primeira vez como uma peculiaridade do sistema imunológico bacteriano.

Parece que as bactérias têm mais a oferecer. Este mês, uma equipe liderada pelo famoso biólogo sintético Dr. George Church, da Universidade de Harvard, sequestrou outra estranha peça da biologia bacteriana. O resultado é uma ferramenta poderosa que pode – em teoria – editar simultaneamente milhões de sequências de DNA, com um “código de barras” para acompanhar as mudanças. Tudo isso sem quebrar uma única e delicada fita de DNA.

Por enquanto, essas ferramentas biológicas, chamadas de “Retron Library Recombineering (RLR)”, só foram testadas em células bacterianas. Mas, como mostra a jornada do CRISPR para a terapia gênica, mesmo as descobertas mais estranhas de criaturas inferiores podem catapultar nossos sonhos mais loucos de terapia gênica ou biologia sintética em realidade.

“Este trabalho ajuda a estabelecer um roteiro para o uso de RLR em outros sistemas genéticos, o que abre muitas possibilidades interessantes para pesquisas genéticas futuras”, disse Church.

Mas, por que o CRISPR é inadequado?
Retrons são estranhos. Em vez disso, vamos começar com CRISPR.

Você já deve estar familiarizado com o funcionamento. Existem dois componentes: um tipo de RNA e uma proteína. O RNA guia “bloodhound” amarra a proteína Cas “tesoura” a um gene específico. Na versão clássica, Cas corta o gene para desligá-lo. Avanços mais recentes permitem que Cas substitua uma letra genética específica ou corte vários genes de uma vez.

Para a versão cortar e substituir, à medida que o gene se cura, muitas vezes ele procura um modelo. CRISPR pode transportar um gene modelo para a célula confiar. Desta forma, a célula é enganada em uma edição de cópia genética: substituindo uma frase genética defeituosa por outra que seja biologicamente gramatical.

O problema com o CRISPR é a fragmentação do DNA. Se você já cortou uma frase em seu telefone, percebeu que cortou os pedaços errados, colou de volta com outra mensagem que agora não faz sentido e clicou em enviar – bem, isso é meio análogo ao que pode acontecer com CRISPR. O perigo de danos ao nosso genoma aumenta quando precisamos editar vários genes. Isso se torna um grande problema na biologia sintética, que usa a manipulação genética para conferir às células novas habilidades ou até mesmo criar organismos completamente novos.

As células são criaturas teimosas desenvolvidas a partir de eras de evolução, então mudar um único gene raramente é suficiente para fazer com que, por exemplo, uma bactéria bombeie biocombustíveis ou medicamentos, tornando necessária a edição de genes multiplexados. A maioria das células também se divide rapidamente, de modo que é essencial para qualquer modificação genética durar gerações. CRISPR freqüentemente luta com ambos. A equipe da Igreja acha que tem uma solução.

Conheça Retrons
A nova ferramenta é chamada de RLR, e o primeiro “R” significa retrons. Essas são criaturas amplamente difundidas, mas totalmente misteriosas, cuja “biologia natural … é amplamente desconhecida”, escreveu a equipe, embora semelhante ao CRISPR, eles podem estar envolvidos no sistema imunológico bacteriano.

Descobertos pela primeira vez em 1984, os retrons são fitas flutuantes de DNA em algumas células de bactérias que podem ser convertidas em um tipo específico de DNA – uma única cadeia de bases de DNA denominadas ssDNAs (sim, é estranho). Mas isso é uma notícia fantástica para a edição de genes, porque as sequências de DNA de fita dupla de nossas células tornam-se cadeias simples impressionáveis ​​quando se dividem. Sincronismo perfeito para uma isca e troca de retrons.

Normalmente, nosso DNA existe em hélices duplas que são firmemente envolvidas em 23 feixes, chamados cromossomos. Cada feixe de cromossomos vem em duas cópias e, quando uma célula se divide, as cópias se separam para se duplicar. Durante esse tempo, as duas cópias às vezes trocam genes em um processo chamado recombinação. É quando os retrons podem entrar furtivamente, inserindo sua progênie ssDNA na célula em divisão. Se eles carregam novos truques – digamos, permitir que uma célula de bactéria se torne resistente a drogas – e se inserem com sucesso, então a progênie da célula herdará essa característica.

Por causa da maquinaria natural da célula, os retrons podem se infiltrar em um genoma sem cortá-lo. E eles podem fazer isso em milhões de células em divisão ao mesmo tempo.

“Descobrimos que os retrons deveriam nos dar a capacidade de produzir ssDNA dentro das células que queremos editar, em vez de tentar forçá-los a entrar na célula de fora, e sem danificar o DNA nativo, que são qualidades muito atraentes”, disse o estudo. autor Dr. Daniel Goodman.

A fabricação de RTR
Semelhante ao CRISPR, o RTR tem vários componentes: o fragmento genético que contém uma mutação (a isca) e duas proteínas, RT e SSAP (transcriptase reversa e proteínas de anelamento de fita simples), que transformam o retron em ssDNA e permitem que ele se insira em uma célula em divisão.

Como em Game of Thrones, há muitos jogadores. Então, para deixar mais claro: os retrons carregam o código genético que queremos inserir; RT o torna em uma forma mais compatível que é chamada de ssDNA; e o SSAP o cola no DNA enquanto ele se divide. Basicamente, um cavalo de Tróia invade a célula e despeja espiões que se inserem na célula – mudando seu DNA – com a ajuda de mágicos enzimáticos.

As duas proteínas são novas para a festa. Anteriormente, os cientistas tentaram usar retrons para edição de genes, mas a eficiência era extremamente baixa – cerca de 0,1 por cento de todas as células bacterianas infectadas. Os dois recém-chegados acalmaram o “sistema de alarme” natural da bactéria que corrige as alterações no DNA – então eles ignoram os novos bits de DNA – e permitem que as edições entrem e passem para a próxima geração. Um outro truque era neutralizar dois genes que codificam proteínas que normalmente destroem o ssDNA.

Em um teste, a equipe descobriu que mais de 90 por cento das células bacterianas admitiram prontamente a nova sequência retron em seu DNA. Em seguida, eles ficaram grandes. Comparados ao CRISPR, os retrons têm uma vantagem, pois sua sequência pode atuar como um código de barras. Isso significa que é possível realizar vários experimentos de edição de genes ao mesmo tempo e descobrir quais células foram editadas com qual retron sequenciando o código de barras.

Em um teste de prova de conceito, a equipe explodiu algumas células de bactérias com retrons que continham sequências de resistência a antibióticos. Ao sequenciar apenas as letras do DNA dos retrons de um pool de bactérias tratadas com antibióticos, eles descobriram que as células com retrons – dando-lhes o novo superpoder contra as drogas – permaneceram em porções muito mais altas do que outras células.

Em outro teste, a equipe tentou determinar quantos retrons eles poderiam usar de uma vez. Eles pegaram outra cepa de bactéria resistente a antibacterianos e dividiram seu genoma para construir uma biblioteca de dezenas de milhões de retrons. Eles então colocaram esses pedaços em bambolês de DNA – chamados de plasmídeos – e os colocaram em células de bactérias. Como antes, a equipe poderia facilmente encontrar os retrons que conferiam poder antibacteriano sequenciando os códigos de barras daqueles que permaneceram vivos.

Mas por que?
É assim que funciona. Mas qual é o porquê?

O objetivo é fácil: encontrar outra solução para o CRISPR que possa influenciar milhões de células de uma vez, sem danificar as células. Em outras palavras, leve a edição de genes para a era do big data, por meio de várias gerações.

Comparada ao CRISPR, a nova ferramenta RLR é mais simples porque não requer uma ferramenta de “guia” além de uma ferramenta de “edição” – um retron é basicamente um dois em um. Ser capaz de influenciar vários genes ao mesmo tempo – sem cortá-los fisicamente – também o torna uma ferramenta intrigante para a biologia sintética. A ferramenta também tem poder de permanência. Em vez de um etos CRISPR “um e pronto”, dura por gerações à medida que as células se dividem.

Dito isso, a RTR tem concorrência. Como funciona melhor com células em divisão, pode não ser tão poderoso em células relutantes que se recusam a se dividir – por exemplo, neurônios. Por outro lado, as atualizações recentes do CRISPR tornaram possível também ativar ou desativar genes – sem cortá-los – por meio da epigenética.

Mas RLR oferece escala. “Ser capaz de analisar bibliotecas mutantes com código de barras agrupadas com RLR permite que milhões de experimentos sejam realizados simultaneamente, permitindo-nos observar os efeitos das mutações no genoma, bem como como essas mutações podem interagir umas com as outras”, disse Church.

Shelly Fan para SingularityHub.

Caroline Verre